培養基里加了TTC，培養出來的細菌還能進行革蘭氏染色鏡檢嗎？
發布時間：
2025-07-17
2,3,5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）作為四唑鹽（tetrazolium salts, TTZ）家族的重要成員，自 1894 年首次被發現以來，便在微生物學領域展現出獨特的應用價值與研究潛力。值得關注的是，在 2021 年 4 月的一次專業交流群討論中，王老師分享了一位網友提出的相關求助問題，群內陳老師針對問題作出了專業解答。今天，我們一同重溫TTC 的核心知識。
一
原理解析：TTC 顯色與革蘭氏染色是否沖突？
1. TTC 的顯色原理
TTC（2,3,5 - 氯化三苯基四氮唑）是一種無色水溶性化合物，其顯色依賴微生物的代謝活性：
活細胞內的脫氫酶可將 TTC 還原為紅色、水不溶性的三苯基甲臜（TPF），TPF 會沉積在細胞內或周圍，使細菌菌落或細胞呈現紅色；而死菌或代謝停滯的細胞無法完成這一還原反應，始終保持無色。這一過程本質是對微生物代謝能力的指示。
2. 革蘭氏染色的原理
革蘭氏染色的區分依據是細菌細胞壁結構的差異：
? 革蘭氏陽性菌（G?）：細胞壁厚，肽聚糖網層次多且交聯致密。經乙醇脫色時，肽聚糖網因失水縮小，能牢牢鎖住結晶紫與碘的復合物，染色后呈紫色。
? 革蘭氏陰性菌（G?）：細胞壁薄，外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差。乙醇脫色時，類脂外膜迅速溶解，肽聚糖網無法阻擋結晶紫-碘復合物溶出，脫色后呈無色，經紅色復染劑處理后最終呈紅色。
結論
革蘭氏染色基于細胞壁結構差異，TTC 顯色則依賴細菌體內脫氫酶與 TTC 的反應，二者機制完全不同，通常不會相互干擾。因此，培養基中添加 TTC 后培養出的細菌，可進行革蘭氏染色鏡檢。
二
TTC 的選擇性抑制作用
TTC 對不同類型微生物的生長抑制效果存在顯著差異，主要體現在對革蘭氏陽性菌和陰性菌的選擇性作用上。
1. 對革蘭氏陰性菌的抑制
大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、普通變形桿菌、宋內志賀氏菌等革蘭氏陰性菌對 TTC 抗性較強。即使 TTC 濃度達到 500μg/ml（摩爾濃度 10?2），仍未表現出抑制效果。
2. 對革蘭氏陽性菌的抑制
革蘭氏陽性菌對 TTC 的敏感性差異較大：
? 0.05% 濃度的 TTC 可完全抑制多數革蘭氏陽性菌、抗酸菌和放線菌的生長；
? 金黃色葡萄球菌抗性較強，在 500μg/ml 濃度下仍能生長；
? 化膿性鏈球菌和枯草芽孢桿菌對 TTC 較敏感，在32μg/ml濃度下不生長，表明 TTC 對這兩種菌有一定抑制作用。
3. 濃度對微生物生長的影響
? 當培養基中 TTC 濃度不超過 0.001% 時，革蘭氏陽性菌、抗酸菌和放線菌可正常生長，且菌落能達到最大著色度；
? 濃度低至 0.0001% 時，所有受試微生物的菌落中均無法觀察到還原產物的顏色；
? 隨著濃度從 0.05% 升至 1.0%，會依次抑制根瘤菌科、無色桿菌科、腸桿菌科及假單胞菌科成員的生長；
? 霉菌可耐受高達 0.25% 的濃度，但在所有濃度下，其菌落中還原態 TTC 的含量都極少。
三
TTC的主要應用
1. 微生物檢測
可用于食品、化妝品、環境等樣本的菌落總數計數，還能抑制菌落蔓延，是食品微生物分析中干燥可復水膜系統（測試片）的關鍵成分。
2. 微生物的選擇性分離與鑒定
?選擇性培養：利用 TTC 對革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑制差異，在培養基中添加特定濃度的 TTC（如 0.01%-0.05%），可選擇性分離革蘭氏陰性菌（如腸桿菌科、假單胞菌科），或抑制雜菌以富集目標菌。
? 初步鑒別微生物種類：不同微生物還原 TTC 的能力不同，可通過顯色強度和速度輔助鑒別。例如，鏈球菌屬中，乳鏈球菌還原能力強，菌落呈深紅色，而乳酪鏈球菌還原能力弱，菌落顏色較淺；酵母菌中，白假絲酵母可形成粉紅色菌落，其他酵母可能為白色，據此可實現初步區分。
3. 微生物代謝動力學分析
? 定量評估代謝活性：液體培養基中，TTC 還原生成的 TPF 量與活菌數量及代謝強度正相關。通過比色法（如在 630nm 波長下測定吸光度）可量化 TPF 的生成速率，反映微生物的代謝動力學特征。
? 生物膜間接定量檢測：生物膜內活細胞釋放的 TPF 可通過比色法檢測，進而評估生物膜的清除率。
4. 跨領域應用
? 農業與植物領域：可用于驗證種子的發芽能力。
? 醫學領域：可對正常活組織、梗死或缺血組織進行染色。
四
TTC 使用的注意事項
1.避光要求：TTC 對光敏感，需避光儲存和培養；培養基配制后應盡快使用，避免自然光導致的非酶促分解。
2.滅菌方式：TTC 溶液需經 0.22μm 膜過濾滅菌，避免高壓滅菌（高溫會使 TTC 自行還原為 TPF）。
3.溶液新鮮度：TTC 溶液建議現用現配，以防氧化失效。若使用低濃度（如 0.05%），可在 4-8℃儲存并重復使用，但需提前驗證其活性。
4.濃度控制：若需使所有細菌菌落更易觀察，TTC 最終濃度不應超過 0.001%；若僅需獲取革蘭氏陰性桿菌的菌落，可安全使用 0.01%-0.05% 的濃度。
5.純度要求：為保證指示效果（顯色清晰、結果可靠、重復性好），建議使用高純度 TTC。
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